【引語】

　　藥物、環(huán)境污染物、化學(xué)污染物等小分子檢測是臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品分析等領(lǐng)域的重要課題。幾十年來，免疫分析作為一種靈敏、簡單、經(jīng)濟(jì)的檢測方式，一直是靶標(biāo)分析物定量檢測的主要手段。免疫分析通常分為兩大類，競爭性分析和非競爭性分析，其中非競爭性分析通常被稱為夾心免疫分析。它們在免疫反應(yīng)中使用的試劑量存在著本質(zhì)上的不同。在競爭性免疫分析中，分析物與標(biāo)記的(或固定的)分析物競爭有限的特異性抗體。相比之下，夾心免疫分析法可以基于過量的兩種不同抗體結(jié)合分析物，提高分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性。然而，夾心免疫分析需要分析物分子具有較大的體積，從而允許至少兩種抗體與兩種表位相結(jié)合。由于空間位阻，小分子不能同時(shí)被兩種抗體結(jié)合，因此通常不使用夾心免疫分析法。由于小分子抗體的結(jié)合腔大多為穴狀，小分子與抗體結(jié)合后大部分被包埋在結(jié)合腔內(nèi)，導(dǎo)致第二個(gè)抗體無法與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而無法建立夾心免疫分析法。半抗原−抗體復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)顯示了小分子如何深埋在接觸表面積為200−400 Å2的穴狀結(jié)合位點(diǎn)，分析驗(yàn)證了這一假設(shè)。典型的小分子(如濫用藥物、抗生素和農(nóng)藥)表面積僅有100−800 Å2，理論上不足以同時(shí)結(jié)合兩種抗體。因此，夾心免疫分析法被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多糖等大分子的檢測，而競爭性免疫分析法則常用于小分子檢測。

　　由于夾心免疫分析的優(yōu)勢，研究人員開發(fā)了小分子檢測的替代方法，如基于抗異型抗體或抗獨(dú)特型抗體的非競爭性免疫分析，固相共價(jià)表位固定化，抗體可變區(qū)片段和競爭性夾心免疫分析。然而，此類分析的實(shí)際應(yīng)用受到了非常規(guī)抗體制備程序和復(fù)雜操作程序的限制。采用兩種不同抗體對(duì)小分子進(jìn)行直接夾心免疫分析的報(bào)道很少，僅有少數(shù)小分子建立了真正的夾心免疫分析法，即:雪卡毒素(1023 Da)、他克莫司(804 Da)、柚皮苷(580 Da)、波那替尼(533 Da)、土霉素(496 Da)和伊馬替尼(494 Da)。對(duì)于一個(gè)小分子，目前還不知道如何評(píng)估建立夾心免疫分析法的可能性，確定允許兩種抗體結(jié)合所需的分析物的表位距離可以為小分子的夾心免疫分析提供有用的線索。此外，抗體−分析物−抗體三元復(fù)合物在小分子夾心免疫分析中的分子識(shí)別機(jī)制尚未被探索，這是半抗原設(shè)計(jì)、抗體發(fā)現(xiàn)和夾心免疫分析建立所必需的結(jié)構(gòu)信息。

　　本研究使用兩種典型的半抗原表位，三聚氰胺(MEL)和對(duì)硝基苯胺(NIA)來解決這些問題，它們由1−14個(gè)烷烴鏈長的線性間隔臂連接，形成9種模型M−N分析物。以新設(shè)計(jì)的12個(gè)半抗原(6個(gè)MEL半抗原和6個(gè)NIA半抗原)為基礎(chǔ)，分別制備兩組MEL和NIA的mAb。通過多種mAb配對(duì)，研究了組合關(guān)聯(lián)性并確定M−N分析物可以同時(shí)被兩種不同的mAb結(jié)合的最小表位距離。采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)和表面等離子體共振(SPR)等方法，進(jìn)一步研究了抗體−分析物−抗體識(shí)別在夾心免疫分析中的分子機(jī)制。最后，通過使用具有大表位的典型鏈狀分子，磺胺−諾氟沙星(SBA−NOR)偶聯(lián)物，作為新型模式分析物，及一種真實(shí)環(huán)狀分析物，阿維菌素(ABM)，驗(yàn)證了本研究的結(jié)論。

【內(nèi)容介紹】

1.

　　本研究的目的是探索小分子夾心免疫分析中分析物的最小表位距離。選擇MEL表位和NIA表位這兩個(gè)半抗原表位，并通過不同長度的線性鏈狀間隔臂來模擬表位距離。因此，設(shè)計(jì)了一個(gè)模式分析物庫，包括9種具有1−14個(gè)甲基間隔臂的化合物，兩端分別為MEL−表位和NIA−表位，并將其命名為M−N分析物(MN1−MN9)，其長度依次增加(圖1a)。

　　圖1.M−N分析物和半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(a)由MEL表位和NIA表位(上)組成的9個(gè)M−N分析物(下)示意圖，表位距離從2.4到19.0 Å (b)不同間隔臂長度的MEL半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原M1(n=1)，M2(n=3)，M3(n=5)，M4(n=7)，M5(n=9)，M6(n=11) (c)不同間隔臂長度的NIA半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。半抗原N1(n=0)，N2(n=2)，N3(n=4)，N4(n=6)，N5(n=8)，N6(n=10) (d)MN3−Me的化學(xué)結(jié)構(gòu)

　　具有不同識(shí)別特性的抗體對(duì)于通過抗體對(duì)篩選來成功建立夾心免疫分析具有相當(dāng)重要的意義，能夠顯著影響兩個(gè)表位最小距離的確定。由于靶標(biāo)分析物完全暴露于免疫系統(tǒng)對(duì)于誘導(dǎo)高特異性抗體至關(guān)重要，為了獲得針對(duì)MEL−表位和NIA−表位的具有盡可能多的識(shí)別特性和多樣性的抗體，在表位和載體蛋白之間建立半抗原間隔臂。設(shè)計(jì)了兩組新的半抗原，并命名為MEL半抗原(M1−M6)和NIA半抗原(N1−N6)(圖1b,c)。這些半抗原以兩個(gè)亞甲基間隔臂的長度均勻增加，以產(chǎn)生對(duì)MEL−表位或NIA−表位具有不同識(shí)別特性的抗體群組。

　　在全合成之前，通過計(jì)算化學(xué)獲得了所有設(shè)計(jì)的M−N分析物的尺寸。計(jì)算結(jié)果表明，最小結(jié)構(gòu)MN1的表位距離為2.4 Å的，表位距離依次增加，最大結(jié)構(gòu)MN9的表位距離為19.0 Å(圖1a)。

　　由于半抗原不能被免疫系統(tǒng)有效識(shí)別，無法誘導(dǎo)后續(xù)抗體反應(yīng)，因此首先將半抗原偶聯(lián)到載體蛋白上。所有半抗原的羧基均與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)作為免疫原，與卵黃蛋白(OVA)偶聯(lián)作為包被抗原，來篩選血清及生產(chǎn)單克隆抗體。如前所述，MEL半抗原−BSA和NIA半抗原−BSA的偶聯(lián)比分別被控制在19.3−23.6和9.0−13.2的適當(dāng)范圍內(nèi)，并成功地通過基質(zhì)輔助激光解吸和電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行了表征。

2.

　　每個(gè)半抗原−BSA分別免疫10只BALB/c小鼠，以21天為間隔周期，免疫3次。半抗原M1−M6和N1−N6免疫12組小鼠的抗血清從第二次免疫開始監(jiān)測。以MEL或NIA為分析物，采用ncELISA和ciELISA測定抗體效價(jià)和親和力。在本研究中，抗體效價(jià)定義為ODmax在1.5−2.0之間的抗血清稀釋度，而抗體親和力表示為MEL或NIA濃度為10 μg/mL時(shí)的抑制率。

　　簡而言之，抗體效價(jià)或抗體親和力越高，表明抗體反應(yīng)越強(qiáng)。所有具有不同間隔臂長度的半抗原在所有小鼠中都產(chǎn)生了對(duì)MEL或NIA的特異性抗體反應(yīng)。此外，抗體反應(yīng)水平主要取決于表位通過間隔臂暴露于免疫系統(tǒng)的程度。本研究旨在產(chǎn)生最大限度地識(shí)別MEL−表位和NIA表位的單克隆抗體，以促進(jìn)M−N分析物的夾心免疫分析的建立。因此，從所有組中選擇對(duì)MEL或NIA具有最高親和力的小鼠來生產(chǎn)mAb，其中，由半抗原M1、M5和M6制備的單克隆抗體由于效價(jià)低和親和力差而失敗。共獲得17株mAb，其中MELmAb6株，NIAmAb11株。具體而言，具有中等間隔臂長的半抗原M3和M4誘導(dǎo)的單克隆抗體與MEL具有相似的親和力，IC50值為16−79 ng/mL。半抗原N3和N4單克隆抗體對(duì)NIA具有較高的親和力，IC50值在81−601 ng/mL之間，比間隔臂長或短的半抗原N1、N2、N5和N6單克隆抗體的IC50值高近2−67倍。

3.M−N

　　為了建立M−N分析物的夾心免疫分析法，對(duì)具有不同識(shí)別特性的6種MEL單克隆抗體和11種NIA單克隆抗體進(jìn)行配對(duì)檢測，。針對(duì)9種模型M−N分析物共產(chǎn)生了1188對(duì)單克隆抗體，每個(gè)M−N分析物有132對(duì)單克隆抗體。由于MEL單克隆抗體作為夾心免疫分析的捕獲抗體具有更高的OD值，NIA單克隆抗體被用作后續(xù)夾心建立的檢測抗體。當(dāng)M−N分析物為100 μM時(shí)，單克隆抗體配對(duì)結(jié)果如圖2a,b所示。對(duì)表位距離較短的模式M−N分析物建立夾心免疫分析的成功率非常低;與表位距離為8.8 Å的MN5相比，幾乎所有單克隆抗體對(duì)MN1−MN4的OD值都非常低(圖2b,c)。結(jié)果表明，捕獲和檢測抗體之間存在空間位阻。當(dāng)分析物的表位距離低于8.8 Å時(shí)，無法形成穩(wěn)定的抗體−被分析物−抗體三元復(fù)合物，導(dǎo)致夾心免疫分析建立失敗。盡管如此，對(duì)于檢測到S/N>2.1的MN1−MN4，仍然有少量如MN1的7A3和17B3(S/N=2.9)的mAb抗體對(duì)仍然具有功能，這是迄今為止描述的最小分析物的夾心免疫分析(圖2)。MN1抗原表位距離為2.4 Å，分子量為304 Da，成功的夾心免疫分析表明，通過仔細(xì)篩選和廣泛配對(duì)mAb，可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)mAb同時(shí)結(jié)合到一個(gè)極小的分析物上。對(duì)于表位距離至少為13.9 Å的分析物MN7−MN9，超過90%的mAb對(duì)能夠建立高效夾心免疫分析，這表明大多數(shù)mAb抗體對(duì)能夠成功同時(shí)結(jié)合。值得注意的是，在所有模式M−N分析物中都觀察到存在不成功的單克隆抗體對(duì)，這表明生產(chǎn)具有不同識(shí)別特性的單克隆抗體對(duì)于建立小分子夾心免疫分析是必要的。

　　圖2.已建立的MN1−MN9夾心免疫分析中mAb的組合 (a)設(shè)計(jì)的夾心免疫分析法示意圖(左)和顏色界限的OD值(右) (b)基于mAb配對(duì)建立的MN1−MN9夾心免疫測定法獲得的OD值。從左到右列的MELmAb和從上到下列的NIAmAb根據(jù)其半抗原間隔臂長由短到長排列 (c)允許夾心免疫測定的mAb配對(duì)百分比是表位距離的函數(shù)

　　來自具有長間隔臂的半抗原的單克隆抗體應(yīng)該具有很深的結(jié)合腔，在大多數(shù)情況下不僅可以識(shí)別分析物表位，還可以識(shí)別間隔臂。不論使用何種捕獲抗體，來自半抗原N5和N6的7F2、1E2和2F5單克隆抗體都在很大程度上阻礙了所有mAb抗體對(duì)的夾心免疫分析，這表明具有深結(jié)合腔的mAb阻礙了分析物的兩種mAbs同時(shí)結(jié)合(圖2b)。相反，具有短間隔臂的半抗原誘導(dǎo)的mAb具有較淺的結(jié)合腔，由于靶標(biāo)分析物的部分暴露，主要識(shí)別MEL或NIA的部分表位。半抗原中間隔臂最短的N1的10A9 mAb抗體對(duì)和MEL 6A8 mAb抗體對(duì)可以同時(shí)與MN4−MN9結(jié)合，表現(xiàn)出mAb較深結(jié)合腔的優(yōu)勢。盡管如此，具有中等間隔臂長度的半抗原N1和N2單克隆抗體的整體夾心形成率遠(yuǎn)低于半抗原N3和N4單克隆抗體。結(jié)果進(jìn)一步表明，應(yīng)避免使用具有超長或短間隔臂的半抗原，以產(chǎn)生合適的抗體，建立有效的小分子夾心免疫分析。

4.M−N

　　選擇半抗原M4的mAb 7A3和半抗原N4的mAb 17B3對(duì)MN1−MN9進(jìn)行夾心免疫檢測。為了評(píng)估分析物表位距離對(duì)免疫分析性能的影響并確定夾心免疫分析的合適分析物表位距離，分別基于7A3和17B3建立了相應(yīng)的MN1−MN9競爭性免疫分析(圖3a,b)。比較競爭免疫分析和夾心免疫分析的檢測限(LOD)、檢測范圍和特異性。隨著M−N分析物表位距離從2.4 Å增加到13.9 Å，基于7A3的競爭性免疫分析對(duì)MN1−MN7的LOD值逐漸從0.2降低到0.001 nM，并且觀察到最長的M−N分析物MN8和MN9(表位距離分別為16.4 Å和19.0 Å)的LOD值增加(圖3c)。同樣，基于17B3的競爭免疫分析的LOD值在表位距離為2.4−19.6 Å的MN1−MN9中逐漸增加，然后下降(圖3d)。半抗原M4和N4誘導(dǎo)的7A3和17B3對(duì)M−N分析物具有明顯的親和力差異，表明mAbs更可能對(duì)間隔臂表現(xiàn)出很大的共同識(shí)別。

　　圖3.(a)基于抗MEL(左)或NIA(右)單克隆抗體的模式分析物的競爭性免疫分析和(b)基于模型分析物的兩種不同單克隆抗體的夾心免疫分析示意圖 (c)針對(duì)MEL、MN1−MN9的競爭免疫測定法和基于mAb 7A3的類似物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (d)針對(duì)NIA、MN1−MN9的競爭免疫測定法和基于mAb 17B3的類似物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (e)針對(duì)MN1−MN9、MEL、NIA和MN3−Me的夾心免疫測定法，使用mAb 7A3作為捕獲抗體，mAb 17B3作為檢測抗體

　　對(duì)于M−N分析物的夾心免疫分析如預(yù)期的那樣，基于7A3−17B3的夾心免疫分析對(duì)所有M−N分析物產(chǎn)生了顯著的劑量依賴信號(hào)(圖3e)。結(jié)果表明，競爭免疫分析和夾心免疫分析對(duì)M−N分析物的靈敏度取決于分子的長度。因此，適當(dāng)?shù)姆肿娱L度可能有助于獲得高靈敏度。對(duì)于表位距離短至6.3 Å的MN1−MN4競爭免疫測定法和夾心免疫測定法都顯示出低靈敏度，競爭性免疫測定法對(duì)分析物的短表位距離更靈敏(圖3)。即使在高濃度(100 μM)的分析物中，夾心免疫分析法也僅檢測到MN1−MN4的微弱的信號(hào)。MN1−MN5的夾心免疫分析的LOD比競爭性免疫分析的LOD至少低3個(gè)數(shù)量級(jí)，這表明由于空間位阻，表位距離低于8.8 Å(MN5)的小分子不太可能被夾心免疫分析靈敏地檢測到。相比之下，夾心免疫分析的LOD非常低，為0.00035~0.9 nM，對(duì)MN6~MN9的檢測范圍比相應(yīng)的競爭免疫分析更廣(LOD為0.001~38.8 nM)。這些結(jié)果表明，小分子夾心免疫分析對(duì)表位距離為11.6~19.0 Å的MN6~MN9具有較高的靈敏度和檢測范圍。在盡可能避免空間位阻的情況下，夾心免疫分析法的靈敏度更高，檢測范圍更廣，因此優(yōu)先使用它來檢測小分子。

　　此外，為了評(píng)估這兩種免疫分析形式的特異性，通過在NIA表位上引入一個(gè)額外的甲基，在MN3的基礎(chǔ)上合成了一種名為MN3−Me的M−N分析物的新結(jié)構(gòu)類似物，如圖1d所示。表S5結(jié)果表明，基于兩種mAb的競爭免疫分析法能夠以與MN3相當(dāng)?shù)撵`敏度檢測MN3−Me，而夾心免疫分析法即使在100 μM也不能識(shí)別此類似物。該夾心免疫分析法使用了兩種不同的單克隆抗體，對(duì)靶標(biāo)分析物具有高特異性，為后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用提供了較高的準(zhǔn)確性。

　　表S5.a使用單抗7A3對(duì)模型分析物進(jìn)行競爭性免疫分析 b使用單抗17B3對(duì)模型分析物進(jìn)行競爭性免疫分析 c使用單抗7A3和17B3對(duì)模式分析物進(jìn)行夾心免疫分析 d夾心免疫法檢測MN3類似物陰性

5.

　　為了進(jìn)一步解釋本研究中小分子夾心免疫分析所利用的抗體−分析物−抗體識(shí)別的科學(xué)基礎(chǔ)，在抗體測序后，通過分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)對(duì)典型M−N分析物復(fù)合物中的7A3−17B3、7A3−10A9和7A3−7F2mAb對(duì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究。與抗體−抗原二元復(fù)合物的對(duì)接不同，很少有用于構(gòu)建抗體−分析物−抗體三元復(fù)合物的方法。根據(jù)先前在蛋白水解−靶向嵌合體(PROTAC)方面的經(jīng)驗(yàn)，我們研究了小分子夾心免疫分析中的抗體−被分析物−抗體三元復(fù)合物。

　　首先測定7A3−17B3共享結(jié)合腔中MEL和NIA之間的距離，用白色表面表示(圖4a)。確定了與7A3−17B3共享結(jié)合腔的理論表位距離為9.2 Å，這意味著在這種情況下可以避免兩個(gè)單克隆抗體之間的空間位阻。隨后，不同表位距離的MN1−MN9被疊加到具有擴(kuò)展構(gòu)象的7A3−17B3的共享結(jié)合腔中。結(jié)果表明，表位距離為2.4−6.3 Å的MN1−MN4太短，無法疊加在共享的結(jié)合腔上，使用這些M−N分析物無法形成穩(wěn)定的抗體−分析物−抗體三元復(fù)合物(圖4b)。當(dāng)MN1−MN4同時(shí)與兩種單克隆抗體結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生空間位阻，因此只能實(shí)現(xiàn)弱夾心免疫分析(圖2b)。將與7A3−17B3共享結(jié)合腔的距離相當(dāng)?shù)谋砦痪嚯x為8.8 Å的MN5疊加在共享結(jié)合腔上，成功生成初始三元復(fù)合物。分子動(dòng)力學(xué)研究表明7A3−MN5−17B3三元配合物構(gòu)象穩(wěn)定，均方根偏差(RMSD)在60~100 ns內(nèi)為0.6 Å(圖4c)。因此，通過實(shí)驗(yàn)和分子動(dòng)力學(xué)研究證明，分析物表位距離為8.8 Å是建立小分子高成功率的夾心免疫分析的最短表位。

　　圖4.分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)研究夾心免疫檢測中的分子識(shí)別機(jī)制。(a)抗體−抗體對(duì)接后，基于與MEL或NIA單抗體對(duì)接的初始構(gòu)象，在7A3和17B3之間形成一個(gè)共享的結(jié)合腔(白色表面)(左) (b)MN1、MN5、MN7、MN9在7A3、17B3組成的共享結(jié)合腔中的重疊圖。MN5可以包含在共享的結(jié)合腔中，而MN1−MN4太短，無法同時(shí)進(jìn)入兩種單克隆抗體的結(jié)合腔(右)。三元配合物的相互作用(c)7A3−MN5−17B3，(d)7A3−MN7−17B3，(e)7A3−MN9−17B3，(f)7A3−MN7−10A9，(g)7A3−MN7−7F2;捕獲抗體(左)和檢測抗體(右)分別用橙色和藍(lán)色標(biāo)記。

　　在上述夾心免疫分析實(shí)驗(yàn)中(圖2和圖3)，基于7A3−17B3的夾心免疫分析對(duì)MN5的靈敏度明顯優(yōu)于MN1−MN4，但遠(yuǎn)差于MN6−MN9，說明分析物的表位距離對(duì)夾心免疫分析的靈敏度至關(guān)重要。然后，研究了使用相同7A3−17B3 抗體對(duì)的MN5、MN7和MN9的夾心免疫分析的分析物表位距離與靈敏度之間的相關(guān)性。在實(shí)際結(jié)合過程中，當(dāng)MN5同時(shí)被7A3和17B3結(jié)合時(shí)存在空間位阻，夾心免疫分析的靈敏度較低，LOD為265.4 nM(圖2)。因此，分析了7A3−MN5−17B3三元復(fù)合物的識(shí)別機(jī)制，以深入了解其相互作用。復(fù)合物的結(jié)合腔主要由7A3的G307以及17B3的R55和N40提供的氫鍵維持。對(duì)于表位距離13.9 Å的MN7，在最大程度上降低了空間位阻對(duì)夾心免疫分析法靈敏度的影響(圖4c)。由7A3的Y379、D327、E319、L439和S370以及17B3的Y210、Y212和Y152的常規(guī)氫鍵和疏水力維持的7A3−MN7−17B3三元復(fù)合物的夾心免疫分析最靈敏，LOD為0.00035 nM(圖4d)。NIA−表位與7A3的S370之間由半抗原M4形成氫鍵，這表明7A3−MN7的結(jié)合腔比7A3−MN5更緊密。因此，與7A3−MN5−17B3復(fù)合物相比，相互作用力的增強(qiáng)使7A3−MN7−17B3復(fù)合物更加穩(wěn)定，提高了其在夾心免疫測定中的靈敏度。MN9的表位距離最長，為19.0 Å，在夾心免疫分析中靈敏度比MN7低2500倍。經(jīng)過分子動(dòng)力學(xué)研究，在20 ns時(shí)得到了預(yù)期的穩(wěn)定三元復(fù)合物7A3−MN9−17B3。夾心免疫分析對(duì)MN9的靈敏度較低，LOD為0.9 nM，這可能是因?yàn)镸N9的表位距離較長，靈活性較高，增加了兩種mAb末端之間的拉伸程度(圖4e)。7A3−MN9−17B3復(fù)合物的0.6Å的RMSD高于7A3−MN7−17B3復(fù)合物的0.4 Å，進(jìn)一步表明分析物的長表位距離可能并不總是有利于具有高靈敏度的夾心免疫分析。應(yīng)考慮由長柔性鏈引起的分析物表位折疊，建立用于小分子的穩(wěn)定的夾心免疫分析。這些結(jié)果表明，抗原表位距離為8.8 Å的分析物可以結(jié)合兩個(gè)具有可接受空間位阻的mAb，表位距離為13.9 Å的分析物可以建立高靈敏度的夾心免疫分析法。

　　與具有最佳性能的夾心免疫分析的7A3−17B3相比，7A3−10A9和7A3−7F2(中等和低性能抗體對(duì)的代表)在不同表位距離的M−N分析物的夾心免疫分析中表現(xiàn)出較低的成功率(圖2)。除了表位距離外，夾心免疫分析法的成功很大程度上取決于所使用的兩種mAb的識(shí)別特性。因此，選擇7A3−10A9和7A3−7F2來研究所選mAb對(duì)夾心免疫分析性能的重要性，并與MN7進(jìn)行了三元復(fù)合物的對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)研究。以NIA半抗原N1和N5分別制備出具有不同識(shí)別特性的mAb 10A9和7F2。與7A3−MN7−17B3三元結(jié)構(gòu)類似，NIA首先對(duì)接到10A9和7F2。7A3−10A9和7A3−7F2共享空腔的表位距離分別為8.3和11.9 Å，表明10A9和NIA的結(jié)合空腔比7F2和NIA的結(jié)合空腔淺?？梢约僭O(shè)N1半抗原中的10A9具有最短的間隔臂，由于載體蛋白的遮蔽作用，可能只能識(shí)別NIA的部分表位，然后形成一個(gè)淺的結(jié)合腔(圖4f)。相比之下，半抗原N5中的7F2具有較長的間隔臂，不僅能識(shí)別NIA表位，還能識(shí)別部分間隔臂，形成深結(jié)合腔。隨后，對(duì)7A3−10A9和7A3−7F2兩對(duì)mAb進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)分析，得到穩(wěn)定的三元復(fù)合物。因?yàn)?0A9的淺結(jié)合腔導(dǎo)致MN7的柔性間隔臂更加暴露，10A9與NIA之間的相互作用僅發(fā)生在7A3−MN7−10A9復(fù)合物的硝基端。這導(dǎo)致分析物折疊，并解釋了夾心免疫分析法的中等性能(圖4f)。在7A3−MN7−7F2中，MN7的NIA−表位深入到7F2的結(jié)合腔中，與7F2中的D338、Q443、Y445形成氫鍵(圖4g)。由于空間位阻，這不利于其他mAb與分析物的同時(shí)結(jié)合，導(dǎo)致夾心免疫分析的性能較差。結(jié)果表明，mAb的識(shí)別特性顯著影響夾心免疫分析的性能，并與所設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。與半抗原N4的17B3相比，間隔臂過短或過長的半抗原的10A9和7F2通常形成淺或深的結(jié)合腔，并產(chǎn)生空間位阻，不適用于小分子的夾心免疫分析。該研究為配對(duì)mAb的選擇提供了重要的參考價(jià)值，可能有助于建立空間位阻較小的夾心免疫分析。

　　值得注意的是，本研究選擇鏈狀模式分析物是為了更直觀地研究夾心免疫分析中兩個(gè)表位的距離極限。因此，從研究中得到的結(jié)論可能并不完全適用于每一種小分子，以建立成功的夾心免疫分析，將在研究結(jié)束時(shí)使用真實(shí)的分析物進(jìn)一步評(píng)估。

6.

　　進(jìn)一步使用SPR分析驗(yàn)證了基于7A3−17B3對(duì)的夾心免疫分析中形成的抗體−分析物−抗體三元結(jié)構(gòu)的特異性結(jié)合。首先，將mAb7A3固定在芯片上，然后，除MN1以100 μM添加外，每個(gè)M−N分析物以10 μM添加。由于MN3和MN8在PBS中的溶解度較差，因此不能用SPR進(jìn)行分析。所有測試的M−N分析物在第I步表現(xiàn)出增加的信號(hào)，表明7A3與M−N分析物成功結(jié)合(圖5a)。隨著時(shí)間的推移，7A3−分析物復(fù)合物逐漸變得穩(wěn)定，在步驟II中觀察到不同程度的解離。隨后加入mAb 17B3結(jié)合7A3−分析物復(fù)合物，在步驟III中，信號(hào)仍然顯著增加，包括最小的分析物MN1。為了確認(rèn)增加的信號(hào)是否是特異性的，設(shè)立了除PBS外不添加任何M−N分析物的對(duì)照組來驗(yàn)證兩個(gè)單克隆抗體之間的結(jié)合。分析過程中PBS信號(hào)維持在基線水平，這表明兩個(gè)mAb之間沒有發(fā)生特異性結(jié)合，步驟III中觀察到的信號(hào)增加是由17B3與7A3−分析物結(jié)合引起的(圖5a)。在加入17B3后，MN1、MN2和MN4的信號(hào)輕微增加了10~20個(gè)單位，而MN6、MN7和MN9的信號(hào)則明顯增加了20~40個(gè)單位，這與已建立的夾心免疫分析中M−N分析物的性能一致。此外，在濃度為1~10 μM的SPR下，MN7在建立的夾心免疫分析法中獲得了最高的靈敏度。在步驟I中，7A3−MN7信號(hào)逐漸增加，在步驟II中，隨著MN7濃度的增加，隨后出現(xiàn)不同程度的解離(圖5b)。在步驟III中加入17B3后，觀察到7A3−分析物−17B3三元復(fù)合物的信號(hào)值升高，再次表明形成了穩(wěn)定的抗體−分析物−抗體三元復(fù)合物。

　　圖5.用SPR和新分析物驗(yàn)證夾心免疫分析 (a)除MN1(100 μM)外，每種分析物使用10 μM對(duì)7A3−被分析物−17B3三元結(jié)構(gòu)進(jìn)行SPR分析 (b)不同濃度MN7(1~10 μM)對(duì)7A3−MN7−17B3的SPR分析 (c)SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR結(jié)構(gòu);SBA和NOR部分分別用綠色和粉紅色標(biāo)記，間隔臂用黑色標(biāo)記 (d)4D11和N2H3A8的SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR夾心免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (e) ABM結(jié)構(gòu)和A表位、B表位和C表位分別用綠色、橙色和紫色標(biāo)記。A與B的表位距離為6.3 Å (f)3A9和2C5對(duì)ABM的夾心免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

7.

　　分別使用廣泛應(yīng)用于人類和獸醫(yī)臨床的典型抗菌藥物SBA和NOR設(shè)計(jì)并合成了兩種新型模型分析物。與M−N分析物類似，合成的SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR分析物屬于鏈狀分子，由SBA−表位和NOR−表位組成，表位距離分別為3.8和13.9 Å(圖5c)。SBA−表位和NOR−表位的表面積分別為325.83和329.53 Å2，大約是MEL−表位和NIA−表位(分別為154.97 Å2和165.20 Å2)的兩倍，因此可以作為較大表位的代表，通過建立成功的小分子夾心免疫分析來進(jìn)一步驗(yàn)證表位距離。本課題組之前制備了抗SBA和NOR的單克隆抗體4D11和N2H3A8，并用于建立夾心免疫分析。兩種模式分析物都成功建立了夾心免疫分析，SBA−C2−NOR和SBA−C10−NOR的LOD分別為0.30和0.02 nM(圖5d)。結(jié)果表明，即使表位距離較短，小分子也可以實(shí)現(xiàn)成功的夾心免疫分析。分析物的表位距離對(duì)夾心免疫分析法靈敏度的影響也被進(jìn)一步研究。表位距離為建議的13.9 Å的SBA−C10−NOR的夾心免疫分析LOD比表位距離為3.8 Å的SBA−C2−NOR低10倍以上(圖5d)。此外，對(duì)于兩種模式分析物，與競爭免疫分析相比，夾心免疫分析在靈敏度和檢測范圍上具有明顯優(yōu)勢，特別是對(duì)于SBA−C10−NOR，LOD提高了近30倍。結(jié)果表明，即使超過2.4 Å的極短表位距離，具有較大表位的小分子也可以實(shí)現(xiàn)靈敏的夾心免疫分析。

　　使用環(huán)狀真實(shí)分析物ABM(一種廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲控制的大環(huán)內(nèi)酯殺蟲劑)進(jìn)一步驗(yàn)證了小分子的夾心免疫分析。設(shè)計(jì)了半抗原ABM−A(之前由本實(shí)驗(yàn)室制備)和ABM−B，并通過在ABM的4”−OH和5'−OH引入間隔臂，分別與載體蛋白KLH偶聯(lián)作為免疫原制備mAb(圖5e)。在對(duì)mAb進(jìn)行大量篩選和配對(duì)后，將半抗原ABM−A產(chǎn)生的3A9與半抗原ABM−B產(chǎn)生的2C5配對(duì)，建立了ABM的夾心免疫分析，LOD為1012.1 nM(圖5f)。夾心免疫法檢測ABM的低靈敏度可能是由于抗體結(jié)合位點(diǎn)重疊造成的空間位阻，降低了各mAb與ABM的結(jié)合能力。ABM的結(jié)果表明，需要仔細(xì)的半抗原設(shè)計(jì)和廣泛的mAb篩選，以建立高靈敏度的夾心免疫分析。本研究表明，小分子檢測的夾心免疫分析并不總是具有優(yōu)勢，這在很大程度上依賴于靶標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)和最佳抗體對(duì)。使用真實(shí)分析物的這些結(jié)果證明，具有一定表位距離的小分子可以用夾心免疫分析法檢測。

【結(jié)論與展望】

　　因?yàn)樾》肿硬荒芡瑫r(shí)被兩種抗體結(jié)合，通常不采用直接的夾心免疫分析法進(jìn)行檢測。本研究證明了通過夾心免疫分析可以檢測到由兩個(gè)表位(僅相隔2.4 Å)組成的相對(duì)較小的分子。通過實(shí)驗(yàn)和理論研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于兩個(gè)表位之間的距離為8.8 Å的表位，夾心免疫分析法的成功率很高。這些結(jié)果表明兩個(gè)mAb與表位距離很短的分析物可以結(jié)合形成三元復(fù)合物。超長表位距離的高靈活性可能會(huì)降低這些抗體−分析物−抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性，降低夾心免疫分析的靈敏度。此外，具有超長或短間隔臂的半抗原誘導(dǎo)的具有深或淺結(jié)合腔的抗體不利于小分子夾心免疫分析的驗(yàn)證。本研究的數(shù)據(jù)能夠引起免疫分析領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，為成功建立靈敏度、檢測范圍和特異性更高的小分子夾心免疫分析提供可靠的參考。

【原文出處】

　　Bai, Y., Fei, J., Wu, W., Dou, L., Liu, M., Shao, S., ... & Wang, Z. (2022). Minimum Distance Between Two Epitopes in Sandwich Immunoassays for Small Molecules.

　　原文鏈接：https://chemrxiv.org/engage/chemrxiv/article-details/62562eb4ed4d88c13a087014

　　指導(dǎo)教師：王戰(zhàn)輝