【摘要】

大麻毒素的高靈敏檢測對(duì)于現(xiàn)場快速篩查非法藥物非常重要，大麻的主要成分為（-）Δ⁹ -四氫大麻酚（THC）。本研究制備了通過N-(3-二甲氨基丙基)-N ' -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯(lián)捕獲抗體的硝酸纖維素膜（NC膜），以檢測抗體-THC免疫復(fù)合物。TEMPO氧化的納米纖維素（TOCNF）具備高體表面積比、OH基團(tuán)豐富、高親水性等優(yōu)點(diǎn)。在表面等離子體共振（SPR）中觀察到抗體牢固結(jié)合在NC膜上且保持了生物活性，檢測范圍為1-10 μg/mL。使用HRP標(biāo)記的檢測抗體作為檢測抗體，通過比色法在紙基上實(shí)現(xiàn)了THC的定量檢測，與依靠靜電作用的物理吸附連接的界面相比，共價(jià)作用連接的界面檢測效率更高。雖然抗體與未修飾的NC膜能夠有效結(jié)合，但超分子吸附導(dǎo)致的捕獲抗體與免疫復(fù)合物的結(jié)合率較低，因此，本研究開發(fā)的錨定捕獲抗體的NC膜具有重要意義。

1. 簡介

據(jù)聯(lián)合國《2021年世界毒品報(bào)告》稱，大麻是全球使用最多的非法藥物，約占全球毒品消費(fèi)量的一半。大麻的主要精神活性成分是（-）Δ⁹ -四氫大麻酚(THC)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的受體結(jié)合可以引起欣快感，四氫大麻酚的代謝物11-甲基-9-羧基-9-四氫大麻酚(THC- COOH)，也是常見的檢測靶分子。隨著即時(shí)檢測需求的增加，唾液中靶標(biāo)的檢測也是十分必要的。為了開發(fā)高度準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法，抗體或其他識(shí)別元件需要有效結(jié)合在檢測界面上，而吸附的不良可能導(dǎo)致抗體喪失生物活性或與流動(dòng)相中的樣品分離。

NC膜通常被用作LFAs的反應(yīng)膜，它能夠不可逆地結(jié)合蛋白質(zhì)，具有良好的信噪比。商業(yè)NC膜通常是疏水的，需要表面活性劑提供流動(dòng)性，但表面活性劑的存在限制了捕獲抗體的結(jié)合。碳二酰亞胺交聯(lián)是使用最廣泛的偶聯(lián)帶有羧基或胺基化合物的方法，已有報(bào)道成功通過EDC/ NHS法將人抗免疫球蛋白抗體偶聯(lián)在TOCNF膜上，此外還有羧甲基纖維素(CMC)膜等。纖維素具有高生物相容性、低成本、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，其吸水性和親水性促進(jìn)了免疫復(fù)合物在水相中的相互作用。然而，在藥物快速檢測領(lǐng)域，基于TOCNF作為識(shí)別元件的錨定界面仍未經(jīng)探索。

方案1. 基于傳感元件固定在纖維素上的THC檢測系統(tǒng)示意圖。特異性抗THC的捕獲抗體(anti-IC)的伯胺基通過 EDC/NHS與 TOCNF 的羧基之間形成酰胺鍵，形成能夠結(jié)合抗 THC + THC 免疫復(fù)合物的生物界面。

方案1展示了TOCNF上的抗體通過EDC/NHS化學(xué)結(jié)合及目標(biāo)免疫復(fù)合物與捕獲抗體結(jié)合的示意圖。SPR的核心部件包括光學(xué)系統(tǒng)、傳感器芯片、液體處理系統(tǒng)三個(gè)主要部分，基于SRP比較了生物界面偶聯(lián)抗體與物理界面吸附抗體的檢測性能。通過比較具有高電負(fù)性TOCNF和電中性纖維素的吸附能力，考察了表面電荷對(duì)分子相互作用的影響。此外，還建立了紙基比色法LFAs，納米纖維素吸水后的膨脹提供了親水間隔環(huán)境，有利于保持固定的捕獲抗體的功能活性，有利于結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的捕獲抗體+THC復(fù)合體，減少了樣本液體流動(dòng)時(shí)檢測抗體被消耗的風(fēng)險(xiǎn)。

2. 結(jié)果與討論

2.1. 捕獲抗體生物界面的制備及SPR中THC的檢測

首先驗(yàn)證了捕獲抗體在TOCNF上的非特異性吸附。圖1a顯示了抗體吸附到TOCNF表面的SPR示意圖，帶負(fù)電的納米纖維素表面對(duì)帶正電的捕獲抗體(等電點(diǎn)6.5-9.5)有顯著的吸附作用，吸附質(zhì)量達(dá)1370 ng/cm²。并對(duì)照捕獲抗體在不帶電荷的纖維素表面上的吸附，在pH值為5時(shí)，捕獲抗體與TOCNF表面的主要依靠靜電作用吸附，顯示其吸附量高于EDC/NHS修飾的TOCNF(圖1A和表1)。此外，研究了表面、THC、捕獲抗體之間的非特異性相互作用，圖1B顯示無封閉試劑時(shí)，檢測抗體在TOCNF上有較高非特異性吸附，圖1C顯示僅有THC存在時(shí)，與TOCNF表面沒有表現(xiàn)出強(qiáng)相互作用，表1展示了非特定相互作用的吸附質(zhì)量。

表 1 SPR中的捕獲抗體固定和非特異性結(jié)合。

圖 1. SPR 傳感圖：a) 在 pH 5 下，15 μg/mL 捕獲抗體吸附到 TOCNF 和纖維素上，b) 15 μg/mL 捕獲抗體吸附在 TOCNF 上，有（藍(lán)色）和沒有（紅色）BSA 封閉， c) TOCNF 吸附 1 μg/mL THC（無封閉）。

此外，對(duì)于TOCNF表面物理吸附的抗體檢測免疫復(fù)合物靈敏度的研究也十分重要。盡管TOCNF上吸附了大量的抗體(圖2a和表1)，但經(jīng)過BSA封閉后不能有效結(jié)合免疫復(fù)合物(表2)，并且免疫復(fù)合物在洗滌后很容易從物理吸附的表面去除，表明物理吸附的抗體以非活性構(gòu)象附著，阻止了免疫復(fù)合物的正確結(jié)合。此外，與免疫復(fù)合物與TOCNF表面的相互作用比較，BSA封閉后TOCNF表面的相互作用具有相似的趨勢(shì)(圖2b)。

圖 2. SPR 傳感圖：a)捕獲抗體吸附到 TOCNF 上。b) 抗 THC + THC 免疫復(fù)合物與 15 μg/mL 抗 THC 和 1 μg/mL THC 吸附在 BSA 處理后的 TOCNF（紅色）和 BSA 阻斷的 TOCNF（藍(lán)色）上物理吸附的捕獲抗體表面上。c)將捕獲抗體偶聯(lián)到TOCNF上，經(jīng)EDC/NHS活化，隨后捕獲抗體和乙醇胺處理。d) BSA 處理后，TOCNF 上偶聯(lián)的捕獲抗體表面上吸附有 15 μg/mL antiTHC 和 2 或 10 μg/mL THC 的抗 THC + THC 免疫復(fù)合物，抗 THC (15 μg/mL) 結(jié)合到不含 THC (0 μg/mL) 的偶聯(lián)捕獲抗體 生物界面作為參考。

此后，比較化學(xué)偶聯(lián)抗體的結(jié)合效率發(fā)現(xiàn)，圖2C顯示出抗體在EDC/NHS激活后的TOCNF表面有較顯著吸附。乙醇胺(pH 8.5)處理后SPR角減小，推測pH的變化影響了蛋白質(zhì)的凈電荷，靜電相互作用的變化使抗體與界面結(jié)合松散。圖2D顯示了兩種濃度的免疫復(fù)合物以及僅有捕獲抗體存在時(shí)與生物界面的結(jié)合情況，與預(yù)期相同，在僅有檢測抗體存在時(shí)固定捕獲抗體的TOCNF表面上的結(jié)合率很低(表2)，而THC存在時(shí)能夠檢測到免疫復(fù)合體的結(jié)合。值得注意的是，盡管THC疏水性較強(qiáng)，但在高度親水的NC膜錨定表面與捕獲抗體發(fā)生了相互作用，可能由于水分子的排出導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)的熵增加，宏觀上增加了捕獲抗體-THC的結(jié)合親和力。捕獲抗體+THC免疫復(fù)合體結(jié)合不能隨的捕獲抗體量的增加而增加(圖2和表2)，高濃度(10μg/mLTHc)使捕獲抗體+THc免疫復(fù)合物結(jié)合率增加約11%，低濃度(2μg/mLTHc)使結(jié)合率降低約25%。

表 2 捕獲抗體固定方法對(duì) TOCNF 表面免疫復(fù)合物結(jié)合的影響。

2.2. 形貌變化

利用AFM成像技術(shù)展示了固載抗體、吸附牛血清白蛋白和免疫復(fù)合物對(duì)表面修飾碳納米薄膜形貌的影響（圖3）。

圖 3. SPR 傳感器上樣品的 AFM 圖像和分布：a) 原始 TOCNF，b) TOCNF 吸附的捕獲抗體生物界面，c) 暴露于 BSA 和 THC + 抗 THC的TOCNF 生物界面，d) TOCNF 偶聯(lián)捕獲抗體生物界面，以及 e) 暴露于 BSA 和免疫復(fù)合物后 TOCNF 上的偶聯(lián)捕獲抗體生物界面。、

2.3. THC在紙基的比色檢測

同樣以TOCNF為錨定層，采用EDC/NHS法將捕獲抗體固定在測試區(qū)(T)上，二抗(抗小鼠免疫球蛋白)附著在對(duì)照區(qū)域(C)上。用HRP標(biāo)記捕獲抗體，在過氧化氫存在下與ABTS反應(yīng)生成藍(lán)綠色產(chǎn)物(圖2),此外，3wt%的牛血清白蛋白和5wt%的酪蛋白水解物溶液作為封閉劑應(yīng)用于底物上，采用THC陽性樣和THC陰性樣進(jìn)行檢測。圖4顯示了不同樣品在測試區(qū)和控制區(qū)的示意圖及相應(yīng)的顏色，四氫大麻酚陰性樣品檢測后，僅在控制區(qū)出現(xiàn)綠色圓點(diǎn)(圖4b)，在對(duì)THC陽性樣品進(jìn)行測試后，在測試區(qū)和控制區(qū)都有著色，10-15 min得到比色結(jié)果（圖4c）。為了突出錨定層和有效固定抗體的重要性，我們?cè)谖锢砦娇贵w的TOCNF上進(jìn)行了類似的測試，其他系統(tǒng)底物沒有著色。

圖4.試紙上的THC檢測：a)在試紙和對(duì)照區(qū)域上顯示固定的傳感元件的示意圖，b)在沒有THC(陰性樣本)存在的試紙上的對(duì)照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合示意圖和Abts的比色圖像，c)在試紙上與THC陽性樣本進(jìn)行檢測時(shí)免疫復(fù)合物結(jié)合和對(duì)照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合的示意圖，以及在試紙上用THC陽性樣本進(jìn)行檢測時(shí)在對(duì)照區(qū)域上的抗THC-HRP結(jié)合的示意圖。

3. 結(jié)論