外泌體樣本的ELISA實(shí)驗(yàn)怎么做？
發(fā)布時(shí)間：2021-08-22 20:33:14來(lái)源：
外泌體（exosomes）是細(xì)胞分泌的微小囊泡，直徑約30-100nm，存在于大多數(shù)體液(如血液、尿液和脊髓液)和細(xì)胞培養(yǎng)液當(dāng)中。近年來(lái)，科研工作者在闡明外泌體的生理、病理生理功能及針對(duì)這些功能的臨床應(yīng)用方面開(kāi)展了大量研究，尤其是疾病的診斷、治療應(yīng)用（如生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)）方面。研究表明，腫瘤細(xì)胞的外泌體會(huì)釋放與血管生成和免疫逃逸相關(guān)的分子標(biāo)志物，說(shuō)明外泌體可能與腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的創(chuàng)建和促腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)1。此外，外泌體表面黏附分子的表達(dá)譜決定了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的終點(diǎn)2?？梢?jiàn)外泌體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的研究?jī)r(jià)值。
在外泌體課題研究中，定量分析自然是必不可少的一步。ELISA是一種較為簡(jiǎn)單的檢測(cè)樣本中特定蛋白或細(xì)胞因子含量的方法。常見(jiàn)的ELISA檢測(cè)樣本有血清、血漿、組織、細(xì)胞上清等，那么外泌體樣本的ELISA（以下均簡(jiǎn)稱exo-ELISA）如何檢測(cè)？應(yīng)用場(chǎng)景是什么？其原理是什么？與普通ELISA技術(shù)相比，exo-ELISA檢測(cè)有哪些不同？讓我們一起來(lái)看看。
一、雙抗體夾心法
將已知的外泌體表面分子（如CD9、CD63、CD81）作為標(biāo)志物，事先將特定外泌體分子標(biāo)志物的一抗包被于板底。當(dāng)加入一定濃度的含外泌體的樣本時(shí)，一抗就可以識(shí)別外泌體表面分子，實(shí)現(xiàn)捕獲外泌體的目的。e.g.常用的ExoELISA-ULTRA外泌體定量分析檢測(cè)試劑盒具有超高的靈敏度。
圖1. 雙抗體夾心法檢測(cè)exosomes原理示意圖
二、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）親和技術(shù)
已知Tim4（T細(xì)胞免疫球蛋白域和含粘蛋白域的蛋白4）可以通過(guò)位于細(xì)胞外區(qū)域的IgV結(jié)構(gòu)域與PS結(jié)合，并具有鈣離子依賴性3。而在螯合劑的作用之下，鈣離子與螯合劑的配位原子相結(jié)合，致使Tim4與PS分離開(kāi)來(lái)。
與雙抗體夾心法不同的是，PS親和技術(shù)檢測(cè)exo-ELISA是使用磷脂酰絲氨酸事先包被的微孔板、生物素化的CD9、CD63、CD81一抗、親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，借助于抗原-抗體反應(yīng)、生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣本中外泌體含量的一種方法。與外泌體表面標(biāo)記的特異性抗體相比，Tim4能夠高效地捕獲來(lái)自多種細(xì)胞類型的外泌體。這種方法也適用于外泌體的純化。
圖3. 不同種類包被蛋白的檢測(cè)靈敏度對(duì)比
三、磁珠法
磁珠法的基本原理是采用生物素標(biāo)記的外泌體，親和素標(biāo)記的磁珠，利用生物素-親和素的結(jié)合反應(yīng)來(lái)對(duì)低外泌體含量的樣本（如尿液、細(xì)胞上清）進(jìn)行純化。
圖4. 磁珠法純化外泌體
四、基因工程的方法
DARPins是人工合成的由兩個(gè)α-螺旋和一個(gè)β-轉(zhuǎn)角的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的合成肽，被設(shè)計(jì)為受體蛋白等多種靶點(diǎn)（如：Her2）的結(jié)合域。DARPin -G3表達(dá)于慢病毒衣殼或細(xì)菌表面，被報(bào)道可用于腫瘤的靶向治療，是具有潛力的、可以克服單克隆抗體局限性的蛋白類治療因子。
Khodashenas等4用重組LAMP-DARPins包裝的慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，使得外泌體表面表達(dá)重組嵌合蛋白。通過(guò)ELISA檢測(cè)外泌體表面重組抗原的表達(dá)，來(lái)表征外泌體的含量。DARPins-G3是專門針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子Her2設(shè)計(jì)而成的，因此可以用于檢測(cè)Her2+的SKBR3細(xì)胞外泌體的含量（圖5）。該方法用于外泌體的捕獲和純化過(guò)程。
圖5. 外泌體表達(dá)的DARPins與細(xì)胞表面Her2分子之間的反應(yīng)
注：用MDA231細(xì)胞作為Her2陰性對(duì)照細(xì)胞，SKBR3為Her2陽(yáng)性細(xì)胞。
五、PD-L1液體活檢新方法的開(kāi)發(fā)
研究表明，循環(huán)外泌體PD-L1水平可以區(qū)分腫瘤的存在，并與免疫治療的反應(yīng)有很好的相關(guān)性。2020年1月由楊朝勇教授4等開(kāi)發(fā)的用于腫瘤液體活檢的外泌體PD-L1 ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)篩選獲得的PD-L1核酸適配體，結(jié)合微量熱泳動(dòng)效應(yīng)，在較少的樣本體積、均質(zhì)性差的體液條件下，能夠獲得均質(zhì)、高效、高靈敏度的檢測(cè)結(jié)果。
篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，MJ5對(duì)癌細(xì)胞表面PD-L1的結(jié)合效果最好，且對(duì)PD-L1陰性細(xì)胞無(wú)明顯的結(jié)合。MJ5適配體經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化得到由33個(gè)核苷酸組成的、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的MJ5C。
流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞MJ5C核酸適配體的熒光強(qiáng)度高于對(duì)照序列，PD-L1陰性細(xì)胞未見(jiàn)明顯的熒光增強(qiáng)（圖7A-B）。
結(jié)合親和力是指單個(gè)生物分子（如蛋白質(zhì)或DNA）與其配體（如藥物）之間相互結(jié)合的強(qiáng)度，通常通過(guò)平衡解離常數(shù) (Kd) 來(lái)衡量。Kd值越小代表配體與蛋白質(zhì)的親和力越大。結(jié)合親和力分析顯示：PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞MJ5C核酸適配體與對(duì)照核酸適配體的熒光強(qiáng)度比不僅遠(yuǎn)高于已報(bào)道的真核細(xì)胞選擇PD-L1蛋白的PD-L1適配體，而且比對(duì)照抗體的熒光強(qiáng)度比高約3倍（圖7C）。這些結(jié)果表明，MJ5C適配體不僅具有良好的選擇性，而且相比于PD-L1抗體組，它與PD-L1的結(jié)合效率更高。這種結(jié)合效率的提高可能是因?yàn)镻D-L1的空間位阻效應(yīng)，而MJ5C核酸適配體比PD-L1抗體小，因此較容易地避免了糖基化所產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)。
為了證明這一假設(shè)，首先用肽-N-糖苷酶F (PNGase F）處理細(xì)胞，以在被適配體或PD-L1抗體染色前削減總N-連接糖基化水平。適配體染色的2組（糖基化/去糖基化組）之間熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化；而與未處理相比，PNGase F處理后PD-L1陽(yáng)性（HCT116）細(xì)胞的抗體染色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖7D-E）。這些結(jié)果表明PD-L1的糖基化阻礙了PD-L1抗體對(duì)其的識(shí)別，而PD-L1適配體MJ5C受空間位阻的影響較小，很可能是由于其體積減小了10倍。因此，與PD-L1抗體相比，MJ5C適配體具有更高的分子識(shí)別能力，可以顯著提高外泌體PD-L1檢測(cè)的敏感性。
圖7. MJ5C適配體與PD-L1抗體的結(jié)合性能比較
以上方法多是基于外泌體表面蛋白的檢測(cè)，那么研究某個(gè)蛋白分子A在外泌體中表達(dá)的基本邏輯思路是怎樣的呢？
首先，確定目的蛋白是位于外泌體囊泡內(nèi)還是囊泡表面。
如果目的蛋白位于囊泡表面，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)即可，不需要透膜劑處理。具體方法為通過(guò)磁珠包被的IgA或者IgG進(jìn)行捕獲，采用CD81/CD63/CD9等作為一抗進(jìn)行檢測(cè)。
如果目的蛋白位于囊泡內(nèi)部，則需要將分離得到的外泌體囊泡做破膜處理，類似于細(xì)胞破膜處理。即用含SDS的RIPA裂解液提取蛋白，然后進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
所謂“細(xì)節(jié)決定成敗”，希望大家在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中多思考，抓住細(xì)節(jié)，多發(fā)高分文章！
【參考文獻(xiàn)】
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