【引文】
提高抗體對(duì)抗原親和力是提高免疫分析方法靈敏度的有效手段，但是通過(guò)免疫動(dòng)物產(chǎn)生的傳統(tǒng)抗體，其親和力容易受到免疫耐受的限制，且由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易于體外改造。相比而言，單域抗體（sdAb），也被稱為納米抗體，因其納米級(jí)尺寸、良好的水溶性、對(duì)惡劣環(huán)境的高耐受性和易于基因操作的特點(diǎn)而更適合于體外誘導(dǎo)親和成熟。目前已有研究者嘗試了許多體外誘導(dǎo)納米抗體親和力提高的方法，但是突變的隨機(jī)性使得篩選過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力，限制了這些方法的應(yīng)用。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)同源建模和分子對(duì)接的組合策略以提供精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)模型，選擇納米抗體抗赭曲霉毒素A（AOA-sdAb）作為模型抗體，分析赭曲霉毒素A（OTA）與AOA-sdAb間的分子相互作用，探索提高親和力的可行途徑。針對(duì)抗赭曲霉毒素A抗體中Nb28關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)丙氨酸掃描確認(rèn)Gly53、Met79、Ser102和Leu149為關(guān)鍵氨基酸，通過(guò)對(duì)這4個(gè)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了兩個(gè)定點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，獲得了親和力提高的突變體Nb-G53Q&S102D，其半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為0.29 ng/mL, KD值為52 nM，分別比原sdAb降低1.4倍和1.36倍。計(jì)算機(jī)模擬分析表明，氨基酸殘基的氫鍵、疏水相互作用和側(cè)鏈位阻對(duì)AOA-sdAb的結(jié)合親和性至關(guān)重要。
【內(nèi)容介紹】
1. 同源建模與分子對(duì)接
將Nb28的氨基酸序列提交至SWISSMODEL在線服務(wù)器獲取其三維結(jié)構(gòu)，從50個(gè)同源模板中選擇相似度為54.88%，GMQE值為0.17，QMEAN評(píng)分為- 1.48的目標(biāo)模板，其中z分?jǐn)?shù)是通過(guò)將Nb28模型的歸一化原始分?jǐn)?shù)（綜合QMEAN評(píng)分和單個(gè)平均力勢(shì)項(xiàng)）與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的一組高分辨率x射線結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算的。如圖1A所示，Nb28蛋白模型的Z-score位于一個(gè)相對(duì)準(zhǔn)確的區(qū)域，表明Nb28模型的大部分氨基酸殘基與預(yù)測(cè)特征吻合較好。此外，Ramachandran圖分析顯示，87個(gè)殘基（94.6%）位于有利區(qū)域，5個(gè)殘基（5.4%）位于可接受區(qū)域（圖1B）。表明Nb28模型的所有骨架扭轉(zhuǎn)角都在可信范圍內(nèi)。說(shuō)明了所選擇的Nb28同源性模型是合理的。
為了預(yù)測(cè)Nb28更穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，在隱式溶劑環(huán)境下對(duì)全原子分子進(jìn)行了動(dòng)態(tài)模擬。動(dòng)力學(xué)仿真前200 ps的均方根偏差（RMSD）值如圖1C所示。RMSD值在前10 ps快速增加，在10 – 200 ps范圍內(nèi)在1.2 Å左右輕微波動(dòng)，具有軌跡的代表性結(jié)構(gòu)特征，可認(rèn)為預(yù)測(cè)的Nb28在200 ps內(nèi)幾乎是恒定的。利用Autodock 4.2將能量最小化后的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)與OTA對(duì)接，如圖1D所示，其中預(yù)測(cè)OTA與Nb28通過(guò)Gly53、Met79、Ser102、Val147和Leu149相互作用，涉及疏水相互作用和氫鍵。這些殘基依次分布在Nb28的FR1、CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域。這一結(jié)果說(shuō)明Nb28的三個(gè)高變區(qū)中上述五個(gè)殘基可能與其抗原結(jié)合活性有關(guān)。
圖1. 最適模型的擬合曲線。（A）z得分結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，（B）Nb28模型的Ramachandran圖分析，（C）第一個(gè)200 ps Nb28的分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)構(gòu)，（D）Nb28和OTA的分子對(duì)接模型。
為了證實(shí)上述結(jié)論，進(jìn)行了丙氨酸掃描實(shí)驗(yàn)，分別在Gly53、Met79、Ser102、Val147和Leu149位點(diǎn)引入了單點(diǎn)突變。然后，表達(dá)和純化5個(gè)Nb28突變體（Nb-Gly53Ala、Nb-Met79Ala、NbSer102Ala、Nb-Val147Ala和Nb-Leu149Ala），并通過(guò)ELISA分析其活性。如圖2A所示，與親本sdAb Nb28相比，三個(gè)突變體（Nb-Gly53Ala、Nb-Met79Ala和Nb-Leu149Ala）的抗原結(jié)合活性顯著降低。Nb-Ser102Ala和Nb-Val147Ala均保留了Nb28的抗原結(jié)合活性。然而，在間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，NbSer102Ala的敏感性比Nb28高1.5倍，NbVal147Ala沒(méi)有觀察到顯著變化（圖2B）。因此，Gly53、Met79、Ser102和Leu149可以被識(shí)別為Nb28與OTA相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，這證實(shí)了圖1D中的分子對(duì)接結(jié)果。
圖2. Nb28與丙氨酸掃描突變的活性分析。（A）Nb28及其突變體抗原結(jié)合能力間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，（B）Nb28、Nb-Ser102Ala和Nb-Val147Ala的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。
2. 突變和噬菌體選擇
使用Mut Express II Rapid Mutagenesis Kit V2將兩個(gè)位點(diǎn)飽和突變引入Nb28的DNA序列，構(gòu)建Gly53&Ser102-mLib和Met79&Leu149-mLib，計(jì)算存儲(chǔ)容量。然后對(duì)兩個(gè)突變文庫(kù)進(jìn)行4次生物篩選，從每個(gè)文庫(kù)中隨機(jī)抽取40個(gè)克隆進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，結(jié)果如圖3A所示，所有Gly53&Ser102-mLib克隆均為陽(yáng)性，隨后，隨機(jī)選取15個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，得到6個(gè)不同的序列，如圖3C所示。與噬菌體VHH28的序列相比，15個(gè)突變克隆的序列在Gly53（Nb-Gly53Asp、Nb-Gly53Lys、Nb-Gly53Leu和Nb-Gly53His）或Ser102（Nb-G53Q&S102D和Nb-Ser102Tyr）上均有兩個(gè)位點(diǎn)突變。然而，從Met79和Leu149- mlib中選擇的克隆在450 nm處的吸光度明顯低于噬菌體VHH28（圖3C），這表明引入Met79和Leu149位點(diǎn)的突變可以顯著降低噬菌體VHH28的結(jié)合活性。
圖3. 突變噬菌體克隆的選擇和測(cè)序。（A）Gly53&Ser102-mLib和（B）Met79&Leu149-mLib噬菌體克隆的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA鑒定，（C）Gly53&Ser102-mLib克隆的6個(gè)DNA序列分析。
3. 突變體的表征和鑒定
6個(gè)不同序列突變體中VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q、VHH- G53Q & S102D三個(gè)克隆的靈敏度較高。選擇IC50最小的克隆VHH-G53Q&S102D構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)和純化后獲得分子量約為18 kDa的Nb-G53Q&S102D，Nb-G53Q&S102D（IC50: 0.29±0.03 ng/mL）的靈敏度比預(yù)期的Nb28（IC50: 0.41±0.01 ng/mL）高1.41倍（圖4B）。并對(duì)兩種單克隆抗體的熱穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明Nb-G53Q&S102D在改變其親本sdAbs中負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的殘基后仍保持了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，具有更高的靈敏度、熱穩(wěn)定性和特異性。
圖4. 突變體的鑒定和表征。（A）噬菌體克隆VHH28、VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q、VHH-G53L&S102Q、VHH-G53H&S102Q、VHH-G53Q&S102D、VHH-G53Q&S102Y的競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，（B）Nb28和Nb-G53Q&S102D的競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，（C）Nb28和Nb-G53Q&S102D分別在20、30、40、50、60、70、80和90°C孵育5分鐘，在20°C下冷卻10分鐘，（D）分別在90°C下孵育0、5、15、25、35、45和55分鐘，然后在相應(yīng)時(shí)間的RT下冷卻后的保留活性。
4. sdAb與OTA交互作用分析
采用“熱泳與T跳”評(píng)價(jià)策略，進(jìn)行了sdAb與OTA的相互作用親和分析，NbG53Q&S102D的親和力比Nb28高1.36倍，該結(jié)果表明，本研究中使用的策略在生成和篩選具有改進(jìn)的OTA親和力的sdAb方面是有效的。為了研究sdAb與OTA的作用機(jī)制，通過(guò)同源性建模和分子對(duì)接來(lái)探討sdAb與OTA關(guān)鍵氨基酸的相互作用。與噬菌體克隆VHH28相比，從Met79和Leu149 - mlib中選擇的突變噬菌體克隆的抗原結(jié)合活性顯著降低（圖3B）。此外，引入Nb28的Met79的丙氨酸突變可以使抗體失活（圖2A）。這些結(jié)果可歸因于Nb28的Met79被其他氨基酸取代，破壞了Met79與Tyr137之間形成的氫鍵（紅點(diǎn)線），如圖5B所示，對(duì)于突變的Nb-G53Q&S102D的第102位氨基酸，天冬氨酸和酪氨酸都可以與Lys107和OTA形成氫鍵，分別如圖5C和D所示。但克隆VHH-G53Q&S102Y在噬菌體ELISA中的敏感性（IC50: 0.87±0.12 ng/mL）低于克隆VHH-G53Q&S102D（IC50: 0.11±0.01 ng/mL），推測(cè)S102Y側(cè)鏈的位阻更強(qiáng)可能導(dǎo)致抗體親和力降低。如圖5E所示，Nb28的Leu149通過(guò)氫鍵和疏水相互作用與OTA相互作用。
圖5. sdAbs與OTA的相互作用分析。（A）Nb28和Nb-G53Q&S102D的歸一化熒光變化，（B）Nb28的Met79與OTA的相互作用，（C）Nb-G53Q&S102D的S102D與OTA的相互作用，（D）Nb-G53Q&S102Y的S102Y與OTA的相互作用，（E）Nb28的Leu149與OTA的相互作用，（F）Nb28與OTA分子對(duì)接模型的結(jié)合孔。
雖然沒(méi)有從Met79和Leu149- mlib中選擇有效的噬菌體克隆（圖3B），但這些相互作用力與Leu149的位阻可能對(duì)Nb28對(duì)OTA的結(jié)合活性和親和力有重要影響?？紤]到Met79在Nb28結(jié)合活性中的關(guān)鍵作用，引入Leu149的單點(diǎn)突變可能是提高抗體親和力的另一種有效策略。如圖4A所示，Gly53和Ser102對(duì)不同氨基酸的突變對(duì)VHH28的敏感性有很大影響。由于Q102和S102都是不帶電的極性氨基酸，且具有相似的簡(jiǎn)單側(cè)鏈，因此Nb活性口袋中涉及的第53位氨基酸的極性和側(cè)鏈位阻可能是導(dǎo)致突變噬菌體克隆敏感性變化的主要原因（圖5F）。隨著G53D、G53K、G53L、G53H序列中第53位氨基酸側(cè)鏈位阻的增加，相對(duì)突變噬菌體克隆的敏感性依次降低（圖4A、圖6）。VHH-G53D&S102Q、VHH-G53K&S102Q克隆的敏感性高于VHH28，這可能與G53D和G53K的極性有關(guān)。此外，第53位氨基酸的電荷可能對(duì)活性口袋有一定的影響，導(dǎo)致VHH-G53D&S102Q的IC50值低于VHH-G53K&S102Q（圖4A）。
圖6. 抗OTA sdAb 第53位4個(gè)氨基酸側(cè)鏈位阻的比較。（A）G53D，（B）G53H，（C）G53L，（D）G53K。
盡管His53是極性氨基酸，但VHH-G53H&S102Q的靈敏度低于VHH28。這可能是由于組氨酸具有很強(qiáng)的側(cè)鏈位阻作用。同樣，亮氨酸的側(cè)鏈位阻也可能是VHH-G53L&S102Q靈敏度低于VHH28的關(guān)鍵因素（圖4A）。因此，通過(guò)修飾sdAb的關(guān)鍵氨基酸可以改變sdAb與OTA的相互作用。
【結(jié)論】
通過(guò)同源性建模、分子對(duì)接和丙氨酸掃描，鑒定出AOA-sdAb Nb28的4個(gè)關(guān)鍵氨基酸（Gly53、Met79、Ser102和Leu149）。對(duì)這些氨基酸進(jìn)行配對(duì)，構(gòu)建了兩個(gè)位點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，從文庫(kù)中篩選出了親和力比親本sdAb Nb28高1.36倍的突變Nb-G53Q&S102D。綜上所述，同源建模和分子對(duì)接結(jié)合丙氨酸掃描和兩點(diǎn)突變的策略適用于生成對(duì)OTA和其他毒性低分子量化合物具有更高親和力的單克隆抗體，同時(shí)計(jì)算機(jī)模擬分析表明，氨基酸殘基的氫鍵、疏水相互作用和側(cè)鏈位阻對(duì)AOA-sdAb的結(jié)合親和性至關(guān)重要。相對(duì)而言，使用同源建模和分子對(duì)接方法成本低、省時(shí)，為提高AOA-sdAb的結(jié)合親和力提供了一種有效的策略，并為sdAb對(duì)其他低分子量化合物的結(jié)合提供了模型基礎(chǔ)。
Wang, X. R., Chen, Q., Sun, Z. C., Wang, Y. D., Su, B. C., Zhang, C. H., Cao, H. M., & Liu, X. (2020). Nanobody affinity improvement: Directed evolution of the anti-ochratoxin A single domain antibody. International Journal of Biological Macromolecules,151, 312-321.
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.02.180
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